Retsch GmbH er markedsleder innen prøvepreparering. Siden 1915 har Retsch utviklet og produsert møller, mortere, knusere i verdensklasse. I denne artikkelen presentere vi Retsch sine løsninger for preparering av biologisk materiale, det være seg celler, vev, planter med mer. Kontakt oss, så hjelper vi deg å finne riktig produkt til dine applikasjoner.
Preparering av biologiske prøver som bein, planter, muskelvev eller ekspektorat for analyse av DNA, RNA, proteiner eller metabolitter kan være utfordrende. RETSCH tilbyr laboratoriemøller og kverneapparater som pulveriserer og homogeniserer faste materialer, men som også er egnet for cellelysering. RETSCH-møller anvendes innen felt som bioteknologi, diagnostikk, rettsmedisin, agronomi og mikrobiologi.
Skroll ned på siden eller trykk her for å laste ned applikasjons-brosjyrer og white papers.
Cellelysering er ofte den foretrukne metoden for å ekstrahere cellulære komponenter fra bakterier, gjær, sopp eller mikroalger, og utføres enten kjemisk eller mekanisk. Mekaniske metoder er bedre egnet for celler med robuste cellevegger, eller når kjemikalier kan interferere med ekstraksjonen og derfor må unngås. En vanlig og effektiv metode er kulemølling, som benytter kuler for å lysere cellene i en suspensjon. Kulemølling kan utføres i liten eller stor skala, ved bruk av ulike typer ampuller og rør. En metode er å blande suspensjonen med kuler og benytte en vortexmikser. Denne prosedyren er imidlertid tidkrevende og lite konsistent, spesielt ved et stort antall prøver eller lange lyseringstider. En mer effektiv tilnærming er å benytte RETSCH mikserkverner med adaptere som automatiserer prosessen, noe som gjør den hurtig, effektiv og reproduserbar.
Videoen viser en eldre modell med identiske funksjonsprinsipper.
Kulemøllen MM 400 kan behandle opptil 20 prøver i 1,5 eller 2 ml mikrosentrifugerør uten krysskontaminering, noe som sparer tid for operatøren. I tillegg er det tilgjengelig en adapter som kan romme opptil åtte 50 ml rør. Optimal kulestørrelse for cellelysering varierer avhengig av celletypen; for bakterier og gjær anbefales glasskuler i størrelsesorden 0,75 til 1,5 mm, mens mindre kuler i området 0,1 til 0,5 mm er mer egnet for sopp og mikroalger.
|
|
Grafene viser: reproduserbarhet av total proteinkonsentrasjon etter celle lysering. 7 min med MM400 (rød) og 12 min Vortex (blå). Standardavvik i %.
For DNA eller RNA-ekstraksjon er mindre engangsrør på opptil 2 ml ideelle, mens større rør som 50 ml rør er godt egnet for prosessering av proteiner eller metabolitter. De optimale parameterne for kulemølling varierer avhengig av celletype. Det kan kreve noe eksperimentering for å finne de beste resultatene. Vanligvis er 30 sekunder (de fleste mikroalger) til 7 minutter (gjær generelt) med kulemølling nødvendig for å fullstendig lysere cellene
Mixer Mill MM 500 vario øker effektivt prøvegjennomstrømningen for cellelysering ved å kunne kjøre opptil 50, 2 ml rør av gangen.
 |
 |
 |
 |
Bilder: Phaeodactylum tricornutum celler før (til venstre) og etter celle lysering (til høyre) med MM400 med 50 ml rør adapter.
Temperatur spiller en avgjørende rolle, spesielt for anvendelser hvor temperaturfølsomme proteiner er involvert, for eksempel ved cellelysering. En løsning er kryogen lysering, en annen er å kjøle cellesuspensjonen. For MM 400 ble det vist at temperaturøkningen i 2 ml rør er moderat selv ved 30 Hz; en enkel metode er å avbryte lyseringstider >1 minutt ved å kjøle adapteren med rørene i et isbad i ett minutt. På denne måten vil temperaturen holde seg under 12-15°C, avhengig av størrelsen på kulene som brukes.
Temperaturøkning under cellelysering i MM 400 ved 30 Hz, eller med en vortexmikser, kjøling på is etter hvert minutt med cellelysering
En måte å kontrollere temperaturutviklingen ved kulemølling på er å bruke Mixer Mill MM 500 control. En spesiell adapter rommer 18, 2 ml rør per batch. Maskinen er koblet til en kjøler med 4°C kaldt vann som kjøler adapteren som holder rørene. På denne måten holdes temperaturen i suspensjonen rundt 13°C, men uten de ubeleilige manuelle avbruddsfasene i et isbad. MM 500 control har ikke adaptere for 50 ml rør, alternativt kan man benytte beholdere i rustfritt stål i volumer på 50, 80 eller 125 ml (se eksempel nedenfor P. pastoris). Hvis møllen brukes med flytende nitrogen og CryoPad og settes til en temperatur på 0°C, kan temperaturen i cellesuspensjonen i 2 ml engangsrør til og med holdes på 0°C uten at suspensjonen fryser, slik at effektiv lysering fortsatt er mulig.
 |
 |
Noen biologiske materialer, som ekspektorat fra pasienter med cystisk fibrose eller vevsprøver som lever, lunge eller svulster, er noen ganger vanskeligere å homogenisere fullstendig. De 2 ml engangsrørene er ofte for små til å romme hele prøvevolumet, så prøven må deles og rekombineres etter homogeniseringsprosessen, noe som legger til ekstra arbeid og tid i laboratorierutinen.
Større homogeniseringskar, laget av rustfritt stål kan holde hele prøvevolumet, men de må rengjøres etter hver bruk.
En adapter for Mixer Mill MM 400 løser dette problemet ved å tillate bruk av 5 x 5 ml engangsrør, som har større kapasitet og ikke krever rengjøring.
Per batch kan 10 prøver homogeniseres samtidig. 50 ml rør kan også brukes til å homogenisere vevsmateriale.
Her kan 8 prøver per batch behandles i løpet av bare noen få minutter.
 |
 |
Leverprøver før og etter homogenisering
Noen biologiske prøver, som fiberrike planter, vanskelige blodårer, fingernegler eller visse dyre- eller svulstvev, er vanskelige å homogenisere i buffer. De er enten for myke, for harde eller for fiberrike til å bli effektivt pulverisert i suspensjon. Et bedre alternativ for disse materialene er kryogen maling, som innebærer å fryse dem med flytende nitrogen før eller under homogeniserings-prosessen. Denne teknikken gjør prøvene sprø og lette å knuse til homogene pulvere. Kryogen homogenisering har også den fordelen at den bevarer integriteten til f.eks. proteiner eller flyktige forbindelser som kan brytes ned eller fordampe ved høyere temperaturer. Dessuten kan kryogen homogenisering bryte de intracellulære organellene i noen organismer, som gjær.
For klebrige materialer, som bær, er kryogen homogenisering ofte den eneste gjennomførbare metoden for å oppnå en homogen prøve. Tabellen lister opp noen eksempler som har blitt vellykket behandlet med kryogen maling i Mixer Mill MM 400 eller CryoMill. 2 ml stålrør kan brukes til kryogen maling i MM 400. Lignende resultater kan oppnås med MM 500 control med homogeniseringskar opptil 125 ml for større volumer. Her må CryoPad brukes for å arbeide med flytende nitrogen. I alle nevnte homogenisatorer er 2 ml rustfrie stålrør og tilhørende adaptere også tilgjengelige for mindre volumer.
| Sample | Accessories | Feed quantity | Grinding time | Speed | Final fineness (d90)/ |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli bacteria |
|
2 x 10 ml frozen cell pellets | 2 min | 30 Hz | complete cell disruption |
| muscle tissue |
|
10 g | 4 min | 25 Hz | <150 µm |
| pine needles |
|
3 min | 30 Hz | Reproducible RNA extraction of 20 samples in one step | |
| berries |
|
2 g | 40 secs | 20 Hz | <200 µm |
| finger nails |
|
1 finger nail per vial | 2 min | 25 Hz | <200 µm |
| rat gut |
|
1.8 g | 2 min | 30 Hz | <150 µm |
Rettsmedisinske prøver som hår, bein og tenner er hovedsakelig sprø og krever derfor vanligvis ikke nedkjøling før pulverisering/homogenisering. For å oppnå ønsket analytisk finhet kan materialet måtte gjennomgå preliminær knusing i en kjefteknuser eller kuttemøller for å redusere partikkelstørrelsene til under 10 mm for videre prosessering i en kulemølle. Kuttemøller brukes til forknusing av bein som kan være ferske og derfor ikke fullstendig tørre, og som til og med kan inneholde vevsrester.
RETSCH tilbyr et utvalg av kuttemøller for primær størrelsesreduksjon av myke, middels harde, elastiske, seige og fiberrike prøvematerialer. Det brede spekteret av tilbehør muliggjør optimal tilpasning til ulike applikasjoner. SM 300 kan utstyres med tre forskjellige rotorer og bunnsikter fra 0,25 mm til 20 mm. I motsetning til ferske og fete bein kan tørre bein reduseres til en størrelse på mindre enn 0,25 mm i ett eller to trinn. SM 300 har en variabel hastighet fra 100 til 3000 rpm. Pulverisering av bein, tenner eller hår utføres hovedsakelig i kulemøller ved bruk av malekuler > 5 mm laget av stål, zirkoniumoksid eller wolframkarbid.
 |
 |
Hårprøver og beinprøver før og etter homogenisering.
En potensiell komplikasjonene ved leddprotesekirurgi, som albuer eller knær, er infeksjon av omkringliggende vev av ulike bakterier. Disse infeksjonene, kalt proteseleddinfeksjoner (PJI), kan oppstå når som helst fra noen dager til flere år etter operasjonen. De er vanskelige å behandle fordi forskjellige typer bakterier kan forårsake dem, og de oppdages ikke alltid med konvensjonelle metoder. Derfor er det nødvendig å isolere bakteriene fra vevsprøvene på en måte som bevarer deres levedyktighet og muliggjør deres identifikasjon og dyrking.
Her kan Mixer Mill MM 400 bidra med en enkel prosedyre: Prøvene blandes med 20 ml sterilt demineralisert vann og 5 ml, 1 mm glasskuler i en sterilisert stålbeholder.
Engangs 30 ml flasker med vid åpning kan brukes. Opptil 8 flasker ristes i 3,5 minutter ved 30 Hz for å fjerne bakteriene fra prøvene uten å ødelegge dem.
Bakteriene kan deretter enkelt dyrkes på en agarplate for videre analyse. Denne metoden har en høy deteksjonsrate og kan anvendes på ethvert fast infisert vev, selv om det inneholder implantat materiale.
Retsch
Retsch
Retsch
Retsch
Retsch
Kulemølling, en mekanisk metode som er mye brukt for cellelysering, er avgjørende for å ekstrahere cellulære komponenter fra mikroorganismer som bakterier, gjær, sopp eller mikroalger. Denne prosessen innebærer bruk av kuler for å lysere celler i en suspensjon og kan utføres i ulike skalaer ved bruk av forskjellige ampuller og rør. Automatiseringen som tilbys av RETSCH mikserkverner med adaptere effektiviserer kulemøllingsprosessen, og sikrer at den er rask, effektiv og reproduserbar.
Optimal kulestørrelse og parametere er celletype-avhengige, noe som krever eksperimentering for å oppnå de beste resultatene. MM 400 kan for eksempel behandle opptil 20 prøver i 1,5 eller 2 ml Eppendorfrør uten krysskontaminering. En tilgjengelig adapter muliggjør bruk av opptil åtte 50 ml Falconrør, noe som øker prosessens allsidighet.
Kryogen homogenisering blir essensiell når man håndterer utfordrende prøver som motstår homogenisering i konvensjonelle buffersystemer. Dette gjelder spesielt for fiberrike planter, seige blodårer, fingernegler eller spesifikke dyre- eller svulstvev. Teknikken innebærer bruk av flytende nitrogen for å fryse prøvene enten før eller under homogeniserings prosessen. Den kryogene frysingen gjør prøvene sprø, noe som letter knusingen til homogene pulvere.
Kryogen homogenisering tilbyr distinkte fordeler, som bevaring av integriteten til proteiner eller flyktige forbindelser som kan brytes ned eller fordampe ved høyere temperaturer. I tillegg er det effektivt for å bryte ned intracellulære organeller i visse organismer. Spesielt er kryogen homogenisering den eneste gjennomførbare metoden for å oppnå ensartede prøver av klebrige materialer, som feks. bær.
For optimale resultater kan kryogen homogenisering utføres ved bruk av spesialisert utstyr som CryoMill eller Mixer Mill MM 400, som rommer 2 ml stålrør. Mixer Mill MM 500 control, som er spesielt designet for arbeid med flytende nitrogen (LN2), og rommer større beholdere opptil 125 ml.
Når det gjelder pulverisering av rettsmedisinske prøver som bein eller tenner, er kjefteknusere eller kuttekvernere det optimale valget for det første trinnet i størrelsesreduksjonsprosessen. RETSCH tilbyr et mangfoldig utvalg av kuttekvernere designet for primær størrelsesreduksjon av ulike prøvematerialer, inkludert myke, middels harde, elastiske, seige og fiberrike substanser. Det omfattende utvalget av tilbehør sikrer at disse møllene kan tilpasses sømløst til ulike applikasjoner.
Den allsidige SM 300 har for eksempel tre forskjellige rotorer og bunnsikter fra 0,25 mm til 20 mm, samt en variabel hastighet fra 100 til 3000 rpm. Denne fleksibiliteten gjør den til et utmerket verktøy for å tilpasse seg spesifikke behov for behandling av rettsmedisinske prøver.
For påfølgende behandlingstrinn, vurder å bruke kulemøller utstyrt med malekuler større enn 5 mm, laget av materialer som stål, zirkoniumoksid eller wolframkarbid. For pulverisering av hår er mikserkverner som MM 400 det beste valget.
