Kvantifisering av DNA i bibliotekarbeidsflyter for neste generasjons sekvensering (NGS)

Selv om det finnes flere NGS-plattformer, er markedet i dag i stor grad dominert av Illumina sine sekvenseringssystemer, med Ion Torrent®-systemene fra Life Technologies som en fjern nummer to (3). Uansett plattform avhenger suksessen med NGS i stor grad av bruk av startmateriale med høy kvalitet og nøyaktig kvantifisert DNA. Denne artikkelen diskuterer rollen DNA-kvantifisering spiller i typiske bibliotekprepareringer for NGS.

Dagens Sanger CE-systemer kan sekvensere et 1-megabase (1Mb) genom til en kostnad på omtrent 2.400 USD; til sammenligning ville det samme genomet koste bare 0,07 USD på et Illumina HiSeq 2000-system.

Ofte stilte spørsmål om neste generasjons sekvensering (NGS)

Hvordan bør jeg rense genomisk DNA for NGS for å oppnå best mulig resultat?
Flere metoder for rensing av genomisk DNA er vanlige før forberedelse av bibliotek til NGS. Enkelte bibliotekprepareringsmetoder er mer sensitive for DNA-kvalitet enn andre. Uansett metode bør all DNA-rensing resultere i DNA som er fritt for organiske forurensninger, som for eksempel fenol eller etanol. I tillegg bør DNA-løsningen ikke inneholde EDTA-konsentrasjoner høyere enn 1 mM.

Resinbaserte metoder er populære for rensing av genomisk DNA til NGS fordi de er raske, gir DNA av høy kvalitet, og kan automatiseres for samtidig behandling av et stort antall prøver. Promega Maxwell® DNA Purification Kits egner seg godt for automatiserte arbeidsflyter og er tilgjengelige i ulike formater for rensing av genomisk DNA fra celler, vev og blodprøver. For manuell behandling tilbyr Promega ReliaPrep® og Wizard® Genomic DNA Purification Kits.

Alle rensingsmetoder bør gi DNA som er fritt for organiske forurensninger, som fenol eller etanol.

Hvor mye DNA trenger jeg for å forberede et NGS-bibliotek?

Mengden input-DNA avhenger av metoden for NGS-bibliotekpreparering, samt den spesifikke typen NGS-applikasjon. For eksempel krever Illumina mate-pair genomiske DNA-sekvenseringsbiblioteker så mye som 10–20 µg DNA, sammenlignet med kromatin-immunutfellingssekvensering (ChIP-Seq), som bruker 10–50 ng input-DNA (2). Uavhengig av plattform kan NGS-bibliotekprepareringsmetoder deles inn i to stadier.

I det første stadiet brytes genomisk DNA ned i mindre biter for å tilpasses de relativt korte leselengdene i NGS. Denne fragmenteringen kan oppnås ved hjelp av mekaniske teknikker som skjærer DNA-et (for eksempel sonikering med Covaris®-instrumenter eller nebulisering med trykkluft). Mekanisk fragmentering resulterer vanligvis i betydelige tap av DNA; følgelig krever NGS-arbeidsflyter basert på mekanisk fragmentering generelt større mengder input-DNA, omtrent 1–5 µg. Disse metodene er best egnet for prøver der DNA-mengden ikke er begrensende, f.eks. dyrkede celler, bakterier eller friske/frosne vevsprøver.

I kontrast kan enzymbaserte metoder, som NEB® Fragmentase™-enzymet, brukes for prøver med begrenset materiale – DNA fra formalinfikserte, parafininnstøpte (FFPE) vev, stamceller eller laser-mikrodissekerte (LCM) prøver. NEBNext Ultra™ DNA Library Prep Kits krever så lite som 5 ng DNA for å forberede Illumina-sekvenseringsbiblioteker; Ion Torrent®-biblioteker krever 100 ng til 1 µg DNA.

NGS-bibliotekpreparering kan deles inn i to stadier: fragmentering og reparasjon av DNA-endene.

I det andre stadiet av NGS-bibliotekpreparering blir endene på det fragmenterte DNA-et reparert (bluntet) ved hjelp av en blanding av DNA-polymeraser. Deretter ligeres spesifikke adaptersekvenser til endene av det fragmenterte DNA-et. Sekvensen til disse adapterne vil variere avhengig av hvilket sekvenseringssystem som brukes. I de fleste arbeidsflyter blir biblioteket deretter amplifisert ved hjelp av PCR for å berike for ditaggede fragmenter (DNA-molekyler som har passende adaptersekvenser i begge ender) og for å produsere tilstrekkelig mengde DNA til sekvensering. For Illumina-biblioteker er PCR-frie arbeidsflyter også tilgjengelige for situasjoner der det er ønskelig å minimere forsterkningsbias. PCR-frie metoder krever større mengder input-DNA enn konvensjonelle bibliotekprepareringsmetoder – vanligvis 1–2 µg DNA for Illumina-biblioteker.

Illuminas Nextera®-bibliotekprepareringskit benytter en unik tilnærming som kombinerer begge disse stadiene i én enkelt enzymatisk reaksjon kjent som tagmentering. Et genmodifisert transposase-enzym fragmenterer og tagger DNA i en ett-rørs prosess, noe som eliminerer behovet for mellomliggende rensings- og ligeringstrinn. Nextera®-bibliotekprepareringskit krever så lite som 50 ng renset genomisk DNA.

Hvorfor er nøyaktig kvantifisering av DNA viktig for å lage NGS-biblioteker?
Sekvenseringsbiblioteker av høy kvalitet bør gi jevn dekning med minimal bias. Nøyaktig kvantifisering av det genomiske DNA-et som brukes som input, sikrer konsistente og reproduserbare resultater fra bibliotekprepareringen.

Det er viktig å velge fluorometriske metoder for DNA-kvantifisering som er spesifikke for dobbeltrådet DNA (dsDNA), siden enkeltrådet DNA (ssDNA) ikke er egnet som substrat for de fleste bibliotekprepareringsteknologier.

Videre bør spektrofotometriske metoder (f.eks. NanoDrop®) som måler absorpsjon av ultrafiolett (UV) lys, unngås. Slike metoder måler total mengde nukleinsyrer i en prøve, i tillegg til forurensninger. Dette betyr at mengden faktisk tilstedeværende genomisk dsDNA lett kan overestimeres på grunn av kontaminerende RNA, ssDNA eller oligonukleotider som også bidrar til den totale UV-absorpsjonen.

Nøyaktig kvantifisering av det genomiske DNA-et som brukes som input, sikrer konsistente og reproduserbare resultater fra bibliotekprepareringen.

Hvilke metoder brukes vanligvis for kvantifisering av input-DNA?
Alle produsenter av sekvenseringssystemer anbefaler fluorometriske kvantifiseringsmetoder som er spesifikke for dobbeltrådet DNA (dsDNA). Qubit® Fluorometer (Life Technologies) og Quantus™ Fluorometer (Promega Corporation) er populære metoder for kvantifisering av genomisk DNA ved NGS-bibliotekpreparering. Fluorescerende fargestoffer som PicoGreen® (Life Technologies) og QuantiFluor® dsDNA System (Promega Corporation) er spesifikke for dsDNA og kan brukes med hvilket som helst fluorometer.

Alle produsenter av sekvenseringssystemer anbefaler fluorometriske kvantifiseringsmetoder som er spesifikke for dsDNA.

Illumina anbefaler bruk av Promegas QuantiFluor® dsDNA System for mer nøyaktig måling av DNA ved forberedelse av Nextera Rapid Capture DNA-biblioteker (4). QuantiFluor®-fargestoffet er spesifikt for dobbeltrådet DNA, med minimal binding til enkeltrådet DNA (ssDNA), RNA, proteiner og forstyrrende forbindelser. Følsomheten til QuantiFluor®-fargestoffet er sammenlignbar med PicoGreen®, og kan måle DNA-konsentrasjoner ned til 10 pg/μl (målekonsentrasjoner på 50 pg/ml).

QuantiFluor® dsDNA System ble utviklet ved bruk av Promegas deteksjonssystemer. Assayet kan brukes både i enkeltprøveformat (rør) og i mikrotiterplateformat (flervelgsformat). QuantiFluor®-systemet er kompatibelt med alle fluorometre som kan måle fluorescens ved eksitasjons- og emisjonsbølgelengdene 504 nm og 531 nm, inkludert Quantus™ Fluorometer og GloMax® Discover og Explorer Systems. Det kan også brukes sammen med GloMax®-Multi Jr Single Tube Multimode Reader.

Figur 1 viser en representativ standardkurve for dsDNA i 96-brønns plateformat. Inne i figuren er det en utvidet visning av den nedre enden av standardkurven.

QuantiFluor®-fargestoffet har ytelsesspesifikasjoner som ligner PicoGreen® (Figur 2). Under forholdene som ble brukt til å generere standardkurvene for assayet, er det dynamiske området for begge fargestoffene omtrent 100 pg til 200 ng per brønn (i 200 µl totalvolum). Deteksjonsgrensen for QuantiFluor®-fargestoffet er omtrent 10 pg per brønn, definert som mer enn tre standardavvik over bakgrunnsfluorescens.

Figur 2. Sammenligning av QuantiFluor® dsDNA-fargestoff og PicoGreen.

Hvordan bør jeg validere ferdige bibliotek før sekvensering?
Nøyaktig kvantifisering av biblioteket er avgjørende for å oppnå optimale NGS-data. Å laste inn mer DNA enn anbefalt kan føre til leseproblemer for instrumentet, knyttet til metning av flowcell eller kuler. På den andre siden kan for lite DNA føre til redusert dekning og lesehastighet.

Mens fluorometriske metoder kan gi nøyaktig og sensitiv måling av DNA-mengden i et sekvenseringsbibliotek, anbefaler produsentene av sekvenseringssystemer bruk av kvantitativ PCR (qPCR) for endelig validering av biblioteket før sekvensering. Enhver bibliotekprepareringsmetode vil produsere noen DNA-molekyler som ikke kan sekvenseres – dette er spesielt relevant for PCR-frie arbeidsflyter, siden det ikke finnes noen forsterkningstrinn for å berike biblioteket med DNA-molekyler som inneholder begge adaptersekvensene.

Ved hjelp av qPCR kan man måle kun de DNA-molekylene som inneholder de riktige adaptersekvensene, fordi PCR-primerne er designet til å matche de spesifikke adapterne som brukes med den aktuelle sekvenseringsplattformen.

Selv om mengden bibliotek-DNA også kan måles ved hjelp av en Bioanalyzer, foretrekkes qPCR og fluorometriske fargestoffbaserte metoder fortsatt for nøyaktig kvantifisering.

Illumina anbefaler bruk av KAPA® Library Quantification Kits for sine sekvenseringssystemer. Standard qPCR-sett for bibliotekskvantifisering er tilgjengelige for alle plattformer fra flere leverandører, og mange forskere velger å lage sine egne qPCR-reagenser. For Ion Torrent®-biblioteker tilbyr Life Technologies qPCR-sett basert på TaqMan®-fluorescerende probe-teknologi.

I tillegg til mengde må også bibliotekets kvalitet valideres
Dette gjøres vanligvis ved hjelp av en 2100 Bioanalyzer (Agilent), et elektroforeseinstrument. Bioanalyzeren gir en visuell fremstilling av fordelingen av DNA-fragmentstørrelser i biblioteket, noe som gjør det enkelt å oppdage potensielle problemer som en høy andel korte DNA-fragmenter eller adapter-dimerer.

Selv om bibliotekmengden også kan måles med en Bioanalyzer, foretrekkes fortsatt qPCR og fluorometriske fargestoffmetoder for nøyaktig kvantifisering.

Oppsummering

Nøyaktig kvantifisering av både input-DNA og det ferdige biblioteket er avgjørende for vellykket NGS. Siden bibliotekpreparering involverer enzymatiske reaksjoner, er det viktig å bruke rensesystemer – inkludert Promega Maxwell®, ReliaPrep™ og Wizard®-systemene – som unngår kontaminanter som kan hemme enzymaktivitet.

Kvantifiseringsmetoder som er spesifikke for dobbeltrådet DNA (dsDNA) gir de mest presise resultatene. Selv om qPCR anbefales for endelig validering av biblioteket, er fluorometriske metoder raske og sensitive nok til nøyaktig kvantifisering av DNA før bibliotekpreparering.

QuantiFluor® dsDNA System er et fluorescensbasert assay som kan måle DNA-konsentrasjoner helt ned til 10 pg/μl ved bruk av et standard fluorometer. QuantiFluor®-assayet og Quantus™ Fluorometer har blitt brukt med suksess til kvantifisering av input-DNA for NGS-bibliotekpreparering i en rekke applikasjoner (referanser 5–12).