Pågående forskning på ccfDNA åpner for muligheten for såkalte "flytende biopsier", som eliminerer behovet for invasiv vevsprøvetaking og potensielt gir et mer helhetlig bilde ved tumoridentifikasjon og -klassifisering i sanntid. Ved kun å bruke lett tilgjengelige blodprøver har forskere nå fått et kraftig verktøy i flytende biopsier som gir nye perspektiver på forskningen. Deteksjon av rent, beriket ccfDNA muliggjør betydelige gjennombrudd på dette området.
ccfDNA er DNA som er frigjort fra celler ved sekresjon, nekrose eller apoptose, og det er påvist i de fleste biologiske væsker, inkludert plasma, urin, cerebrospinalvæske, fostervann, pankreassaft, spytt, svette og tårer, blant andre. Omtrent 95 % av ccfDNA i sirkulasjon har en størrelse på cirka 170 bp, tilsvarende den molekylære størrelsen på DNA som er pakket rundt et nukleosom. En mindre andel består av dimerer (340 bp) og trimerer (510 bp).
Bruk av ccfDNA som prøvemateriale er imidlertid ikke uten utfordringer. Den lave konsentrasjonen og fragmenterte naturen til ccfDNA, kombinert med lav frekvens av biomarkører av interesse, skaper flere barrierer for utbredt bruk av ccfDNA-overvåkning. Variasjoner i prøvetypen og håndtering av prøvene kan påvirke mengden kontaminerende genomisk DNA med høy molekylvekt (gDNA). Tilstedeværelse av høye nivåer av slikt gDNA kan gjøre det vanskelig å oppdage mutasjoner i lavfrekvente ccfDNA-fraksjoner. Størrelsesselektive metoder basert på magnetiske kuler, slik som ProNex® Size-Selective Purification System, kan brukes til å berike ccfDNA-komponenten i en prøve. Dette eliminerer større DNA-fragmenter og reduserer bakgrunnssignal uten å påvirke nivåene av 170 bp-fragmentet.
Materialer og metoder
-
ProNex® Size-Selective Purification System (Kat.nr. NG2001)
-
Magnetisk rørsstativ, f.eks. MagneSphere® Technology Magnetic Separation Stand (Kat.nr. Z5332)
-
95 % etanol for klargjøring av vaskebuffer
-
(valgfritt) LoBind-rør kan brukes ved ønske under størrelsesseleksjonsprotokollen og ved lagring, f.eks. Eppendorf® DNA LoBind Tubes (Kat.nr. 022431021)
Protokoll for opprensing av ccfDNA
-
Klargjør vaskebuffer som beskrevet i seksjon 5 i ProNex® Size-Selective Purification System Technical Manual #TM508.
-
La ProNex®-kjemien stå og temperere til romtemperatur i 30 minutter til 1 time.
-
Pipetter 50 µl isolert ccfDNA i et rør eller brønn som rommer opptil 250 µl.
Merk: For startvolum andre enn 50 µl, juster volumene av ProNex®-kjemi tilsvarende for å opprettholde forholdene angitt i trinn 5 og 10.
-
Pass på at korken på flasken med ProNex®-kjemi er skrudd godt igjen. Resuspender harpiksen ved kraftig vortexing i 10 sekunder.
-
Tilsett 55 µl ProNex®-kjemi til prøven (dvs. et forhold på 1,1:1 (v:v) ProNex® til 50 µl prøvemengde) og bland ved pipettering 10 ganger.
-
Inkuber prøven ved romtemperatur i 10 minutter.
-
Plasser prøven på en magnetisk holder i 2 minutter.
-
Overfør forsiktig supernatanten til et rent rør eller brønn.
OBS: Ikke kast supernatanten! Det ønskede DNA-fragmentet finnes nå i supernatanten. DNA med høy molekylvekt er bundet til harpiksen.
-
Fjern prøven fra magnetstativet.
-
Tilsett ytterligere 95 µl ProNex®-kjemi til supernatanten fra trinn 7 (dvs. 1,9:1 forhold i volum til 50 µl startvolum, totalt 3:1 sluttforhold), og bland ved pipettering 10 ganger.
-
Inkuber prøven ved romtemperatur i 10 minutter.
-
Plasser prøven på magnetisk stativ i 2 minutter.
-
Fjern og kast supernatanten forsiktig. Den inneholder uønskede, lavmolekylære DNA-fragmenter. Det ønskede ccfDNA vil nå være bundet til harpiksen.
-
Mens prøven fortsatt står på magnetstativet, tilsett 200 µl vaskebuffer og inkuber i 30–60 sekunder. Fjern og kast vaskebufferen.
For større prøver, øk volumet av vaskebuffer proporsjonalt med totalvolumet av prøve og ProNex®-kjemi.
-
Gjenta trinn 14 én gang til (totalt to vask).
-
La prøven lufttørke i 5 minutter.
Notater: Hvis du bruker en flerkanalspipette og bufferrenne, kan ubrukt vaskebuffer returneres til flasken nå. Husk å stramme korken for å unngå fordampning av etanol. Harpiksen kan lufttørkes i mer enn 5 minutter. Avhengig av følsomheten til nedstrøms applikasjoner for etanol, kan tørketider opptil 1 time brukes. ProNex®-kjemi påvirkes ikke negativt av dette.
-
Fjern prøven fra magnetstativet.
-
Tilsett 50 µl Elution Buffer (eller ønsket volum, se notat nedenfor) og resuspender harpiksen ved pipettering og/eller risting på platemikser. Inkuber ved romtemperatur i 5 minutter for å eluere DNA-et.
Notat: Du kan tilpasse volumet av Elution Buffer avhengig av nedstrøms applikasjon. Større elueringsvolumer gir ikke nødvendigvis høyere utbytte. Volumer lavere enn 25 % av startvolumet kan føre til noe tap av utbytte.
-
Plasser prøven på magnetstativ i 1 minutt, og overfør deretter forsiktig det eluerte DNA-et til et rent rør eller brønn.
-
Sett flasken med ProNex®-kjemi tilbake til lagring ved 2–10 °C.
Resultater
ccfDNA ble isolert fra fersk, dobbelt-sentrifugert plasma ved bruk av Maxwell® RSC ccfDNA Plasma Kit, og tilsatt 10 ng/µl HCT116 genomisk DNA (gDNA). Etter at DNA-et var tilsatt, ble halvparten av prøvene behandlet med ProNex® Size-Selective Purification System (størrelsesselektert), mens den andre halvparten ikke ble behandlet (kontroll).
DNA ble deretter størrelsesbestemt og visualisert ved bruk av D5000 ScreenTape på Agilent TapeStation. ccfDNA-båndene på 166 bp og 332 bp var uendret, uavhengig av om størrelsesseleksjon ble utført eller ikke. Imidlertid ble det observert en betydelig reduksjon i båndet over 10.000 bp – der man forventer at gDNA vises – i størrelsesselekterte prøver sammenlignet med kontrollene (Figur 1).
Både de størrelsesselekterte og kontrollprøvene ble videre amplifisert i en hydrolyseprobe-basert differensiell qPCR-analyse (ProNex® DNA QC Assay) rettet mot tre forskjellige fragmentlengder: 75 bp, 150 bp og 300 bp. Forholdet mellom 75 bp og 300 bp ble brukt som en måleparameter for ccfDNA-renhet. Et lavt forhold bekreftet tilstedeværelse av tilsatt gDNA i kontrollprøven, mens et høyere forhold ble observert i de størrelsesselekterte prøvene, noe som indikerer effektiv fjerning av gDNA med høy molekylvekt (HMW gDNA) (Figur 2).
Figur 1. Størrelsesfordeling av ccfDNA tilsatt 10 ng/µl gDNA, med eller uten størrelsesseleksjon. Prøver ble kjørt på D5000 ScreenTape med Agilent TapeStation. Falske gelbilder vises til høyre.
Figur 2. Forholdet mellom amplifisering av 75 bp- og 300 bp-fragmenter i ccfDNA tilsatt gDNA, med eller uten størrelsesseleksjon. Forholdet mellom 75 bp og 300 bp-fragmenter ble målt i hver prøve ved bruk av ProNex® DNA QC Assay. N = 4 for hver betingelse.
Konklusjon
Selv om ccfDNA har stort potensial som kilde til DNA-basert informasjon, kan den lille fraksjonen av sirkulerende molekyler av interesse – sammenlignet med genomisk DNA (gDNA) fra lyserte hvite blodceller eller variasjoner i prøveinnsamling og -håndtering – føre til begrenset sensitivitet i nedstrøms analyser.
Vi har vist at bruk av en størrelsesseleksjonsmetode etter innledende opprensing kan forbedre berikelsen av ccfDNA. Dette øker sannsynligheten for å kunne påvise relevante lavfrekvente biomarkører i applikasjoner som digital dråpe-PCR (ddPCR) eller massivt parallell sekvensering (NGS).
