Er din MTT-analyse virkelig det beste valget?

Selv om MTT-analysen er blitt utbredt i bruk, blir den ofte brukt feil som følge av manglende forståelse for hvordan analysen fungerer og dens begrensninger. Det finnes flere utfordringer forbundet med bruk av MTT-metoden. En økt bevissthet rundt disse begrensningene har fått erfarne forskere til å velge andre analysemetoder som er bedre tilpasset deres applikasjoner og som tilbyr forbedrede egenskaper sammenlignet med MTT-metoden. Under er en kort beskrivelse av noen av ulempene ved MTT-analysen, samt alternative eller komplementære metoder som kan møte disse utfordringene.

Hvordan MTT-analysen fungerer

MTT-forbindelsen (3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-tetrazoliumbromid) er løselig i cellekulturmedium og permeabel for celler. Reagenspulveret tilberedes vanligvis i fosfatbufret saltvann (PBS), tilsettes direkte til cellene i kultur til en sluttkonsentrasjon på 0,2–0,5 mg/ml, og inkuberes i 1 til 4 timer. Levedyktige celler reduserer tetrazoliumforbindelsen til et lilla formazanutfellingsprodukt som akkumuleres både inne i cellene og i kulturmediet. Et andre reagenstilsetningstrinn benyttes for å løse opp de krystallinske formazanutfellingene før kvantifisering ved måling av absorbans ved 570 nm. Mengden absorbans er proporsjonal med antallet levedyktige celler.

MTT-analyser er sjelden det beste valget for å estimere antall levedyktige celler in vitro.

To-trinns prosedyre

Selv om MTT-analysen er en homogen analyse, krever den to reagens-tilsetninger og flere trinn. Etter at MTT-reagenset er tilsatt, må platene returneres til inkubatoren ved 37 °C i 1–4 timer for at signalet skal utvikles. Deretter tilsettes en oppløsningsløsning, og absorbansen måles. Utviklingen av alternative analyser, som ATP-analysen (2–4), som involverer færre trinn og ikke krever at platene returneres til inkubatoren, har satt MTT-analysen i en ugunstig posisjon. ATP-analysens enkle «tilsett–miks–mål»-protokoll har ført til økt bruk i high-throughput applikasjoner. Tilgjengeligheten av analyser som krever færre trinn og eliminerer behovet for å returnere platene til inkubatoren, er trolig den viktigste årsaken til den minkende populariteten til MTT-analysen og den økte bruken av ATP-analysen (2–4).

MTS-baserte levedyktighetsanalyser tilbyr et homogent, «tilsett–miks–mål»-alternativ til kolorimetriske levedyktighetsanalyser.

Begrensninger ved MTT-analysen

Den opprinnelige publiserte metoden for MTT-analysen beskriver bruk av forsuret isopropanol for å løse opp formazankrystallene. pH-verdien i oppløsningsløsningen justeres til å være sur, noe som fører til at fenolrødt i cellekulturmediet omdannes til sin gule form. Dette bidrar til å unngå interferens ved måling av absorbansen til formazanproduktet. Selv om denne sammensetningen fortsatt er mye brukt, kan organiske løsemidler føre til utfelling av proteiner fra serum-supplert kulturmedium, noe som igjen kan forårsake lysspredning (5). Fordampning av flyktige løsemidler og ustabilitet i formazansignalet er blant ulempene knyttet til oppløsningsløsninger. Det er rapportert at fargen til formazan løst i sur isopropanol er «stabil i noen timer ved romtemperatur» (1).

I litteraturen er det beskrevet flere forbedringer av oppløsningsløsningene, inkludert bruk av DMSO, dimetylformamid, SDS, og kombinasjoner av detergenter og organiske løsemidler (1, 6–9). Selv om ulike organiske løsemidler i liten grad kan endre absorbansmaksimum for formazanproduktet, utgjør dette vanligvis ikke et problem på grunn av det brede absorbansspekteret (6). En kombinasjon av detergent og organisk løsemiddel, justert til sur pH, gir tilstrekkelig oppløsning og stabiliserer absorbansverdiene slik at data kan registreres flere dager senere, om nødvendig. Det bør imidlertid tas i betraktning at bruk av detergenter i oppløsningsløsningen kan øke risikoen for bobledannelse i brønnene, noe som kan føre til variasjon i data mellom replikater. Korrekt avhending av mikrotiterplater som inneholder organiske løsemidler er en annen moderat ulempe ved MTT-analysen. Hver stat eller lokal institusjon har trolig egne regler for håndtering av organiske løsemidler, og disse må vurderes sammen med eventuelle spesialprosedyrer for avhending av biologisk materiale.

Mangel på sensitivitet

Absorbansbasert deteksjon, som benyttes i MTT-analysen og andre tetrazoliumreduksjonsanalyser (f.eks. MTS, XTT, WST-1, WST-8), er generelt mindre sensitiv enn fluorescerende og luminescerende metoder for å påvise levedyktige celler. Denne manglende sensitiviteten begrenser muligheten for å miniaturisere analysen til high-throughput screening (HTS). Selv om deteksjonssensitiviteten varierer betydelig mellom ulike celletyper og avhenger av den metabolske aktiviteten til cellene som testes, kan tetrazoliumbaserte analyser typisk påvise 200–1 000 celler per brønn under optimale forhold. Sensitiviteten kan forbedres ved å optimalisere MTT-konsentrasjonen og inkubasjonstiden med cellene, men inkubasjonstiden er begrenset av MTT-reagensets toksisitet (10).

Til sammenligning gir bruk av luminescerende ATP-baserte analyser eller RealTime-Glo™ MT Cell Viability Assay, som detekterer cellenes reduserende kapasitet, mulighet for å detektere færre celler per brønn og er bedre egnet for HTS-applikasjoner.

MTT-analyser brukes ofte til å vurdere 3D-mikrovevskulturer ved bruk av Matrigel® som substrat. På grunn av sin forbedrede lyserende evne, er imidlertid CellTiter-Glo® 3D Assay bedre egnet til å penetrere 3D-mikrovev og gi mer pålitelig signal.

Kjemisk interferens
Analysebetingelser som påvirker den kjemiske eller enzymatiske reduksjonen av MTT, kan føre til økt bakgrunnsabsorbans og forstyrrelser i analyseutfallet. En rekke kjemiske forbindelser er kjent for å forstyrre MTT-analysen. Dette gjelder særlig reduserende forbindelser som forårsaker ikke-enzymatisk reduksjon av MTT til formazan. Eksempler inkluderer askorbinsyre, vitamin A, svovelholdige forbindelser som redusert glutation, koenzym A og ditiotreitol (11–14). Kjemikalier som frakobler elektrontransportkjeden fra oksidativ fosforylering av ATP, er også kjent for å påvirke MTT-analysen negativt (15). I tillegg er det rapportert at planteekstrakter og polyfenoliske forbindelser kan interferere med MTT-analysen (16–17). Langvarig eksponering av MTT-reagenset for lys eller forhøyet pH i kulturmediet kan også føre til formazandannelse og høyere bakgrunnsabsorbans. Det er derfor viktig å inkludere riktige kontrollprøver (f.eks. MTT-reagens og testforbindelse i kulturmedium uten celler) for å avdekke kjemisk interferens i analysen. Alternativt kan man benytte en ortogonal levedyktighetsanalyse som detekterer en annen biologisk markør, for å bekrefte resultatene. For eksempel kan cytoplasmatisk aminopeptidaseaktivitet påvises ved bruk av det fluorogene substratet GF-AFC (CellTiter-Fluor™-analysen (18)), som også kan kombineres (multiplexes) med den kolorimetriske MTT-analysen.

Toksisitet
Selv om MTT-analysen er mye brukt, har MTT-reagenset vist seg å være cytotoksisk, og tilsetning av reagenset for å estimere cellelevedyktighet kan i seg selv skade eller drepe cellene i løpet av eksperimentet. MTT er rapportert å være toksisk for eukaryote celler (10). Eksponering for MTT førte til markante morfologiske endringer i cellene under dannelsen av formazankrystaller (Figur 1). MTT-analysen benytter reduserende ekvivalenter som koenzymet NADH for å omdanne MTT til det fargede formazanproduktet. Det å lede NADH bort fra kritiske cellulære funksjoner og over mot MTT-reduksjon, kan ha skadelige effekter på cellens helse. Lü et al. spekulerte i at selve formazankrystallene kan forårsake skade på cellemembranen under eksocytose (19). Alternative analyser måler andre biomarkører som er mindre avgjørende for cellens overlevelse. Det cellepermeable GF-AFC-substratet for aminopeptidaseaktivitet i CellTiter-Fluor™-analysen er kjent for å være et mindre toksisk alternativ, og det fluorescerende signalet gir dessuten flere muligheter for kombinasjon med andre analyser (10, 18).

Figur 1. Effekt av MTT-eksponering på cellenes morfologi. Balb 3T3-fibroblaster ble dyrket i 96-brønns plater over natten for å sikre god celleadhesjon, og deretter behandlet med MTT til en sluttkonsentrasjon på 0,8 mg/ml før fotografering. Alle bildene viser det samme cellefeltet på ulike tidspunkter etter tilsetning av MTT-reagenset, og ble tatt med IncuCyte™ FLR (Essen Biosciences). Platene forble i inkubatoren under fotograferingen. Cellene vises ved følgende tidspunkter med MTT-inkubasjon: 0 timer (panel A), 1 time (panel B), 2 timer (panel C) og 3 timer (panel D).

Tetrazoliumreduksjon reflekterer cellens metabolisme – ikke celleantall

Selv om resultatene fra MTT-analyser generelt korrelerer med antallet levedyktige celler under standard kulturforhold, gjenspeiler tetrazoliumreduksjon i realiteten den generelle metabolske aktiviteten – spesielt glykolytisk produksjon av NADH – snarere enn det faktiske celleantallet (20–21). Reduksjonshastigheten til MTT påvirkes av kulturbetingelser (f.eks. pH og glukoseinnhold i mediet) og cellenes fysiologiske tilstand. For eksempel produserer Con A-aktiverte lymfocytter omtrent ti ganger så mye formazan per celle som ikke-aktiverte celler (1). I tillegg vil celler i rask vekst som monolag ha ulik metabolsk aktivitet sammenlignet med celler som har differensiert, vokst til konfluens eller blitt senesente. Det er viktig å forstå den biologiske bakgrunnen for den målte markøren i enhver analyse. Innsikt i hvilke cellulære funksjoner eller spesifikke markører som bidrar til et målbar signal, kan også bidra til å forklare artefakter i resultatene.

Begrensninger ved multiplexerbare analyser

Multiplexing gjør det mulig å hente mer informasjon fra én enkelt brønn. I MTT-analysen ødelegger imidlertid tilsetningen av løsningsmiddel for å oppløse formazankrystallene cellestrukturen og trolig også det meste av enzymaktiviteten, noe som begrenser muligheten for å kombinere MTT med andre analyser – med mindre den andre analysen gjennomføres før løsningsmiddelet tilsettes. Ved å bruke analyser som ikke dreper cellene, eller som ikke er basert på akkumulering av signal over tid, får man flere muligheter for multiplexing etter at cellelevedyktighet er målt. Eksempler på dette er:
– CellTiter-Fluor™-analysen, som bruker det cellepermeable GF-AFC-substratet for å måle proteaseaktivitet (18),
– RealTime-Glo™-analysen, som kontinuerlig måler reduserende kapasitet i levedyktige celler i sanntid,
– CellTox™ Green-analysen, som er basert på et ikke-permeabelt DNA-bindende fargestoff som kun farger døde celler (22).

Mitokondrier er ikke den eneste kilden til MTT-reduksjon

Da MTT-analysen først ble utviklet, antok man at «egenskapene stemmer overens med at MTT kun spaltes av aktive mitokondrier» (1). Denne antagelsen, og ideen om at enzymet suksinatdehydrogenase var direkte involvert, var basert på tidlige studier med hemmere som virket på spesifikke steder i mitokondriets elektrontransportkjede (23). Nyere forskning har imidlertid tilbakevist dette dogmet og vist at MTT ikke nødvendigvis reduseres i mitokondriene (13, 20–21). Studier viser at NADH er hovedansvarlig for MTT-reduksjon, og at denne prosessen skjer både i mitokondriene, cytoplasmaet og i membranene i endosom/lysosom-komplekset samt plasmamembranen. MTT-reduksjon ved plasmamembranen kan forklare observasjoner av formazankrystaller utenfor cellene.

Variasjon mellom reagensbatcher

MTT-pulver er tilgjengelig fra en rekke kommersielle leverandører. Selv om informasjon om renhetsprosent ikke alltid er oppgitt, er kvaliteten på MTT-pulveret generelt tilfredsstillende. Likevel kan variasjon mellom forsøk oppstå som følge av feilaktig tilberedning, lagring og håndtering av MTT-løsningen. Mange forskningslaboratorier har ikke standardprotokoller for fremstilling og kvalitetskontroll av reagenser som kan virke enkle å tilberede. Korrekt merking (inkludert utløpsdato), lagring beskyttet mot lys, og minst en visuell inspeksjon for å bekrefte at løsningen er klart gul før bruk, vil bidra til å unngå feil i eksperimentet. Et alternativ for å redusere risikoen er å benytte kommersielt produserte og kvalitetskontrollerte MTT-reagenssett (6).

Det finnes nå alternative analysemetoder som muliggjør gjentatt sanntidsmåling av både levende og døde celler i samme prøve, ved å kombinere (multiplexe) ulike kjemiske deteksjonsprinsipper.

Alternativer til MTT-analysen